天狼猩紅總膠原檢測(cè)試劑盒

Sirius Red Total Collagen Detection Assay Kit（Catalog # 9062）

僅用于科研，不可用于診斷

背景簡(jiǎn)介：

天狼星紅是一種*的染料，它與纖維性膠原（I型至V型）上的[Gly-X-Y]n螺旋結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，不區(qū)分膠原蛋白種類和膠原類型，因此用于總膠原的檢測(cè)。Chondrex提供天狼星紅總膠原蛋白檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)樣本，包括：組織、細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞中的總膠原蛋白。該試劑盒可檢測(cè)40例樣本（復(fù)孔），實(shí)驗(yàn)時(shí)間少于30min。由于細(xì)胞培養(yǎng)液總的膠原含量較低，可能需要對(duì)樣本做濃縮處理。

產(chǎn)品說明：

產(chǎn)品描述：用于檢測(cè)樣本中的總膠原

形式：96孔可拆版

檢測(cè)方法：比色法

實(shí)驗(yàn)時(shí)間：30min

檢測(cè)范圍：500 µg/ml to 8 µg/m

檢測(cè)數(shù)量：40（復(fù)孔）樣本/板

樣本類型：組織勻漿、細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞

樣本稀釋比：根據(jù)樣本類型而定

發(fā)色團(tuán)：N/A(510-550nm讀取)

保存：-20℃ 保存12個(gè)月

試劑盒組成：

注：1）洗液，提取液，0.5M的醋酸和96孔板也可以室溫保存

2）用于細(xì)胞培養(yǎng)液樣本的的濃縮液（50 ml, Catalog # 90626)）不包括在盒子內(nèi)，需要單獨(dú)訂購。

樣本制備：

可用于檢測(cè)組織勻漿樣本和細(xì)胞。固體樣本需要溶解后檢測(cè)。此外，細(xì)胞培養(yǎng)液需要做濃縮處理（請(qǐng)參照第三頁實(shí)驗(yàn)步驟）。另外，熱變性的膠原對(duì)天狼猩紅的結(jié)合性差，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果值偏低。

依據(jù)溶解緩沖液的不同，以下膠原樣本可用于檢測(cè)：

1. 中性緩沖液溶解的膠原溶液（0.15mol/L NaCl in 0.1M Tris-HCl, pH 7.4）

2. 醋酸溶解的膠原溶液（0.05mol/L的醋酸）

3. 含胃蛋白酶的膠原溶液（0.05mol/L的醋酸，含胃蛋白酶）

Chondrex 推薦“制備含胃蛋白酶的可溶液膠原溶液"制備方案

細(xì)胞培養(yǎng)液樣本制備：

含高濃度血清的細(xì)胞培養(yǎng)物會(huì)導(dǎo)致高背景值。因此，我們推薦用PBS降低細(xì)胞培養(yǎng)物中的血清濃度到5%。

樣本濃縮：

細(xì)胞培養(yǎng)物中的血清濃度一般來說很低，因此用試劑盒直接檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物中的膠原很難檢測(cè)得到。Chondrex公司通過濃縮液（Cat # 90626)參照樣本濃縮流程對(duì)樣本進(jìn)行濃縮。如果檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物，請(qǐng)?jiān)O(shè)置陰性對(duì)照，用濃縮液的話可能會(huì)導(dǎo)致背景升高。

1. 加入1ml細(xì)胞培養(yǎng)液

2. 加入250ul濃縮緩沖液

3. 渦旋混勻后，4℃孵育16-24小時(shí)

4. 10000rpm離心3min

5. 棄上清液

6. 加入100ul 0.05mol/L的醋酸溶解沉淀物。用溶解后的樣本，作為檢測(cè)樣本。

7. 樣本中膠原濃度為測(cè)定值x0.1。

操作流程：

1. 加入100ul稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本到管內(nèi)。

2. 加入500ul天狼猩紅溶液到管內(nèi)

3. 混勻后，室溫孵育20min,10000rmp離心3min,小心吸取上清，并棄上清。

4. 加入250ul提取液到各管內(nèi)。

5. 渦旋混勻使沉淀物*溶解。

6. 從各管內(nèi)取200ul到檢測(cè)板

7. 讀取530nm(510-550nm)吸光度

注意：

1. 推薦標(biāo)準(zhǔn)品和樣本均做復(fù)孔檢測(cè)

2. 所有的緩沖液在用前置于室溫平衡。

3. 用移液管準(zhǔn)確定量緩沖液體積，提供的緩沖液都是足量的。

4. 如果一次用不完的原液試劑，請(qǐng)還在原瓶?jī)?nèi)-20℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

5. 試劑盒含有未感染的動(dòng)物的動(dòng)物組分，丟棄請(qǐng)做生物安全處理。

實(shí)驗(yàn)流程：

1. 1X醋酸溶液制備：用雙蒸水，制備足夠的1X醋酸溶液（0.05M）。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品制備：用1.5ml離心管或者細(xì)胞培養(yǎng)管制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入250ul 0.05mol/L的醋酸（空白）到7管內(nèi)。加入250ul標(biāo)準(zhǔn)品（500ug/ml）和等體積的0.05mol/L的醋酸混合（250ug/ml）。一次重復(fù)此步驟，制備：125,63,31.5,16，和8ug/ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液

1. 樣本制備：用1.5ml離心管或者細(xì)胞培養(yǎng)管制備樣本溶液。如果樣本中的膠原濃度范圍不確定，需要用0.05mol/L的醋酸溶液做系列稀釋后，確定樣本大概范圍后再檢測(cè)。

2. 加入樣本和標(biāo)準(zhǔn)品：加入100ul ,空白，稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本到離心管內(nèi)，做復(fù)管。

3. 加入天狼猩紅溶液：加入500ul天狼猩紅溶液到各管。渦旋混勻，室溫孵育20min。

4. 離心：10000rpm離心3min。去除上清，不要接觸底部的沉淀物。如果不小心接觸到，重新離心，小心去除上清。

5. 加入洗液：加入500ul洗液到各管。渦旋混勻后，重懸沉淀物。

6. 離心：10000rpm離心3min。去除上清，不要接觸底部的沉淀物。如果不小心接觸到，重新離心，小心去除上清。

7. 加入提取液：加入250ul提取液到各管。渦旋混勻后，充分溶解。

8. 讀數(shù)：從各管取200ul到96孔板。讀取510-550nm的吸光度值。

結(jié)果計(jì)算：

1. 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品，空白和檢測(cè)樣本的OD平均值。

2. 用標(biāo)準(zhǔn)品和樣本OD平均值減去空白OD均值。

3. Y軸做OD值，X軸做標(biāo)準(zhǔn)品濃度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4. 通過回歸曲線計(jì)算樣本濃度。樣本實(shí)際濃度應(yīng)在測(cè)值的基礎(chǔ)上乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

5. 如果OD值超出標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)范圍，請(qǐng)對(duì)樣本做稀釋后，再檢測(cè)。